現場核酸檢測技術平臺的建立
發表時間 2019-01-07 14:21 來源 本站原創

  劉威鄒大陽 賀曉明 董德榮 黃留玉*

  解放軍疾病預防控制中心

  黃留玉研究員,博士、博士生導師,解放軍疾病預防控制所原所長,中華預防醫學會常務理事、轉化醫學專業委員會主任委員,中國衛生監督協會常務理事。2004年畢業于河南醫科大學,后來分別在軍事醫學科學院和第三軍醫大學獲得碩士和博士學位。主要從事生物安全和軍隊疾病預防控制管理、理論和技術研究。領導創建解放軍疾病預防控制所,主編《軍隊疾病預防控制》專著,發明系列疾病預防控制技術。主持完成的“軍隊傳染病監測系統和主動防控新模式研究”2014年獲得軍隊科技進步一等獎。獲得國內外發明專利30多項,發表SCI論文70多篇。

  摘要

  針對核酸檢測存在的試劑必須低溫保存、操作復雜、需要儀器設備多等不適于現場應用的難題,打破國外技術壟斷,發明了新型恒溫核酸擴增技術——聚合酶螺旋反應,率先實現了一個酶一對引物的恒溫核酸擴增;攻克Bst聚合酶、逆轉錄酶、dNTP、引物等熱敏生物分子常溫保存技術難關,發明了一體化核酸檢測管,實現的核酸檢測試劑的常溫儲運、開蓋即檢和防止污染;突破核酸檢測必須先提取核酸的技術常規,發明了多功能樣品處理管,具有病原滅活、核酸暴露、抑制物去除和定量加樣等功能;成功研發了便攜式恒溫實時熒光檢測儀,以及50多種配套檢測試劑盒。集成為“一簽(普通棉簽)、兩管(樣品處理管、核酸檢測管)、一儀器”現場核酸檢測技術平臺,具有“三易(試劑易保存、技術易操作、結果易判讀)、一少(儀器應用少)、一快(檢測時間不超過1個小時)”的顯著特點,為傳染病、食品安全及實發公共衛生事件的現場檢測提供了有力的技術支撐。

  前言

  核酸檢測因其較高的敏感性和特異性,在傳染病、食品安全等領域得到廣泛應用。由于核酸檢測所用的擴增酶、dNTP、引物等熱敏成分必須要在-20度保存、實驗操作比較復雜、需要較多儀器設備甚至是比較昂貴的儀器設備,使核酸檢測在現場難以應用。為此我們建立一個現場核酸檢測技術平臺,克服了一般核酸檢測技術的不足。

  1、聚合酶螺旋反應技術

  核酸恒溫擴增技術都是國外發明的技術,有嚴格的專利保護。我們通過在普通PCR引物的基礎上從靶序列上取一段序列N,將這段序列加到PCR引物(F和B)的5’端,構成了兩條復合引物Ft和Bt(圖1)。 形成了既不同于PCR、也不同于其它恒溫擴增技術的新型核酸恒溫擴增技術(圖1),我們命名為聚合酶螺旋反應(Polymerase Spiral Reaction,PSR)。具有靈敏度高(最低可檢測10拷貝/µl),特異性強,反應快(10-50分鐘)等特點。 通過改進等溫擴增反應體系,添加pH指示劑和核酸熒光染料,形成了擴增結果熒光和顏色變化雙重判別(圖2)。 打破了國外的技術壟斷,獲得了國內發明專利(ZL201410535579.1)和國際發明專利(PCT/CN2015/000493)。



圖1 PSR引物組成及其在靶序列上的結合位點



圖2 PSR熒光檢測和顏色變化觀察

  2、多功能樣品處理管

  按照一般技術常規,核酸檢測必須首先進行核酸提取。雖然核酸提取有多種方法,但操作相對比較復雜。為此我們提出了核酸檢測只需要核酸暴露而非必須核酸提取的理念;優選出既能裂解病原暴露核酸,又不抑制后續擴增反應的樣品處理液;自主設計的結構簡單、價格低廉的一次性塑料管。組成了多功能樣品處理管(圖3),操作簡單(圖4),具有病原滅活、核酸暴露、抑制物去除和定量加樣等功能。經多種樣本、多種病原的比較研究,達到了商用核酸提取試劑盒的應用水平(表1)。獲得了三項國內專利(ZL201410333527.6;ZL201420387897.3;ZL201520738093.8;)和第一類醫療器械備案憑證一個(京經械備20170039號)。



圖3、多功能樣品處理管



圖4、多功能樣品處理管使用流程

表1、多功能樣品處理管處理樣品效果比較



注:結核桿菌樣本提取效果熒光定量PCR結果比較,1、2、3、4分別代表樣本中不同的結核桿菌菌落數1:107 CFU/ml;2:106 CFU/ml ;3:105 CFU/ml ,4:104 CFU/ml,每個樣各有一個平行對照。

  3、一體化核酸檢測管

  針對核酸檢測試劑必須超低溫保存、操作復雜、易污染等難題,建立了生物分子常溫玻璃化技術工藝,使酶等生物分子的常溫保存時間超過12個月;發明了防污染隔離物(ZL201210371448.5 ),能有效防止核酸擴增中產生的氣溶膠污染,降低核酸檢測的假陽性。將酶、引物、dNTP等熱敏成份玻璃化到PCR管蓋內,將耐熱離子液放入管底,中間用防污染隔離物進行隔離,發明了全部核酸檢測試劑成份的一管化預裝新劑型——一體化核酸檢測管(圖5),實現了試劑的常溫保存,大大簡化了操作(圖6)。獲得了國內專利(ZL201620156170.3)和國際發明專利(PCT/CN2016/085076)。



圖5、一體化核酸檢測管示意圖



圖6、一體化核酸檢測管操作步驟

  4、便攜式恒溫實時熒光檢測儀及配套試劑

  我們研制的檢測試劑可以根據顏色變化進行結果判定,只要有一個水浴鍋配合就能開展工作。為了使檢測更精準客觀,我們研制出了一臺F8型便攜式恒溫實時熒光檢測儀,8通道、中文界面、觸屏操作,還能手機遠程同步顯示檢測結果(圖7)。成功研發了40多種常見病原檢測試劑盒。

  現場核酸檢測技術平臺在西非埃防控博拉疫情、贊比亞防控霍亂疫情、國家口岸檢疫、部隊疫情防控中成功應用,推動了國家及軍隊在傳染病、生物反恐和突發公共衛生事件現場控制的技術進步。



圖7 F8型便攜式恒溫實時熒光檢測儀

篮球小说